98. Jahrestagung der DOG 2000
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Mechanische Isolation und Kultivierung von adultem retinalem Pigmentepithel aus humanen Spenderbulbi
K. H. Eibl, A. Neubauer, U. Welge-Lüßen, A. Kampik
Ziel: Mechanische Gewinnung von adultem retinalem Pigmentepithel (RPE) aus humanen Spenderbulbi, dessen Physiologie nicht durch den Einsatz von proteolytischen Enzymen bei der Isolation verändert wurde.
Methoden: 16 humane Spenderbulbi wurden nach post-mortem Zeiten von etwa 24 Stunden enukleiert und in Wachstumsmedium transferiert. Nach kornealer Trepanation wurden Iris und Linse zirkulär abgetragen, der Glaskörper aus dem Bulbus rotiert und die Netzhaut am Sehnervenkopf abgetrennt. Mit einem auf eine Rhexisnadel gesteckten Silikonschlauch oder einer Sautter-Kanüle konnten RPE-Zellverbände von der Aderhaut abgestreift werden. Die RPE-Zellen wurden in 2 ml DMEM, 20% FCS transferiert und in ein 35 mm Zellkulturschälchen ausgesät. Das Wachstumsverhalten unter Standard-Zellkulturbedingungen wurde fotografisch dokumentiert und ausgewertet.
Ergebnisse: Nach vier Tagen wuchsen die RPE-Stücke adhärent am Boden der Zellkulturschälchen. Nach etwa einer Woche zeigte sich ein von den Rändern der RPE-Stücke ausgehendes Zellwachstum, das mit einer fibroblastenartigen Entdifferenzierung der RPE-Zellen einherging. Die RPE-Stücke, von denen das Wachstum ausging, entdifferenzierten nicht. Die konfluenten RPE-Primärkulturen stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung.
Diskussion: Eine mechanische Isolationsmethode von RPE-Zellen ist Voraussetzung für Untersuchungen der extrazellulären Matrix und des Retinoid Metabolismus dieser Zellen, deren Integrität und Funktion durch Einsatz von proteolytischen Enzymen wie Trypsin empfindlich gestört werden kann (von Recum et al., Exp Eye Res 1999). Auf proteolytische Enzyme zur Gewinnung dieser Zellen (Valtink et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1999) kann verzichtet werden.
Zusammenfassung: Adulte retinale Pigmentepithelzellen können mechanisch aus humanen Spenderbulbi isoliert werden und erreichen innerhalb von vier Wochen Konfluenz.
Augenklinik der LMU München, Mathildenstr. 8, D - 880336 München
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