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Impressum
Die Behandlung von kultivierten humanen RPE-Zellen mit Glaskörper führt zur verminderten Expression von 10 Genen
Kociok N., Hueber A., Esser P., Thumann G., Welsandt G., Kirchhof B.
Universitäts-Augenklinik, Abt. für Netzhaut- u. Glaskörperchirurgie, Universität Köln
Einleitung: Die Exposition von RPE-Zellen zu Glaskörper ist
ein wichtiger Risikofaktor für proliferative Vitreoretinopathie.
Um Gene in humanen RPE-Zellen zu identifizieren, deren Expression nach
Behandlung mit humanem Glaskörper verändert ist, haben wir eine
differenzielle mRNA Expressionsanalyse (DEmRNAPCR) durchgeführt.
Methoden: Kultivierte humane RPE-Zellen der Passage 3 wurden für
48h mit 25% humanem Glaskörper oder als Kontrolle mit serumfreien
Medium inkubiert. Die Gesamt-RNA der Zellen wurde isoliert und einer DEmRNA-PCR,
mit nachfolgender Polyakrylamidgelelektrophorese und Silberfärbung
der resultierenden Banden unterzogen. Die differentiell amplifizierten
cDNAs wurden durch DNASequenzierung und Homologiesuche in der Gendatenbank
identifiziert. Die Genexpression der identifizierten Gene in RPE-Zellen
in vivo wurde durch RT-PCR verifiziert und die Stärke der mRNA-Expression
durch Real Time RT-PCR quantifiziert, wobei die Expression von GAPDH zur
Normierung der Proben diente.
Ergebnisse: Die mRNA-Expression von 8 der 10 analysierten Gene
in RPE-Zellen wurde hier zum ersten Mal nachgewiesen. Als Folge der Behandlung
der Zellen mit Glaskörper verminderte sich die mRNA-Expression des
Transkriptionsfaktors "nuclear factor I-B2" (NFIB2), des Ankyrin-Wiederholungeseinheiten
enthaltenden Proteins KE03, des Proteins "phosphatidylinositol glycan
of complementation class B" (PIG-B), des Proteins DKFZp564B1462,
der Leukotrien-A4-Hydrolase (LKHA4), des Mikrotubuli-assozierten Proteins
1B (MAP1B), des das RAS-GTPase aktivierende Protein (GAP)-bindende Protein
(G3BP), des Proteins assoziert mit Myc (PAM), der inaktiven Variante des
E2 Ubiquitin-konjugierenden Enzyms (UEV- 1) auf 0,69 bis 0,17 verglichen
zur Expression der korrespondierenden Gene in nicht-behandelten Zellen.
Die UDP-GalNAc:polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase T1 (UDP-GalNAc-T1)
mRNA zeigt keine differentielle Expression in behandelten verglichen zu
unbehandelten Zellen.
Schlußfolgerung: DEmRNA-PCR in Kombination mit Real Time-RT-PCR
ist eine effektive Methode zur Identifizierung und Verifizierung differentiell
exprimierter Gene, ohne daß einschränkende Vorannahmen getroffen
werden müssen. Die veränderte Expression der identifizierter
Gene in den glaskörperbehandelten RPEZellen könnte ein Teil
des Prozesses sein, der letztlich zur PVR führt. Die Aufdeckung der
Funktionen dieser Gene in RPE-Zellen könnte dazu beitragen, neue
Therapiemöglichkeiten der PVR zu entwickeln. Gefördert von DFG
(Es 82/5-3, He 840/6-3), Köln Fortune Programm and Retinovit-Stiftung