Programm & Abstracts                 "Innovationen in der Augenheilkunde"

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In-vitro-Differenzierung mesenchymaler Stammzellen in Zellen mit einem neuronalen Phänotyp

1Linke S., 2Eisermann E., 2Zander A., 1Richard G., 3Schachner M., 2Lange C., 3Bartsch U.,
1Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde (Hamburg)
2Einrichtung für Knochenmarktransplantation, Universitätsklinikum Eppendorf (Hamburg)
3Zentrum für Molekulare Neurobiologie Hamburg (ZMNH), Institut für Biosynthese neuraler Strukturen (Hamburg)

Hintergrund: Untersuchungen zum Differenzierungspotential adulter mesenchymaler Stammzellen (MSZ) aus dem Knochenmark der Ratte in eine neuronale Richtung in vitro.
Methode: MSZ wurden aus dem Knochenmark von Sprague Dawley Ratten gewonnen und in vitro expandiert (Haynesworth et al. 1992): nach gründlichem „Ausspülen“ des Knochenmarks (Femur und Tibia) wurden die Zellen in Plastik-Kulturflaschen transferiert und in einem DMEM-Medium mit 20% fötalem Kälberserum expandiert. Nach der dritten Passage wurde die Differenzierung der Zellen (Dichte ~2500 Zellen/cm2) durch ein Medium mit 5% fötalem Kälberserum, 0,5mM 3-isobutyl 1-methylxanthin (IBMX) und 10µM Forskolin oder durch ein serumfreies Medium mit 2% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 200µM Butyl-Hydroxianisol (BHA) induziert. Die morphologische Differenzierung wurde durch Phasen-Kontrast Mikroskopie analysiert und die differenzierten Zellen immunzytochemisch mit ß-Tubulin III und Neurofilament Antikörpern charakterisiert.
Ergebnisse: MSZ konnten in unserem Zellkultursystem rasch und effektiv expandiert werden. Nach drei Passagen konnte die homogene (FACS-Analyse) und undifferenzierte Zellpopulation durch zwei unterschiedliche Differenzierungsprotokolle (Woodbury et al., 2000; Deng et al., 2001) in morphologisch neuronal erscheinende Zellen differenziert werden; bereits 45 Minuten nach Beginn des Differenzierungsprotokolls (DMSO/BHA) wurden einige der undifferenzierten und flachen Zellen sphärisch und begannen, Neuriten-ähnliche Fortsätze auszubilden. Nach einer Inkubationszeit von acht Stunden im Differenzierungsmedium hatten mehr als 75% der Zellen eine Neuron-ähnliche Morphologie. Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration mit IBMX und Forskolin hingegen resultierte in einer langsameren Differenzierung einer nur kleinen Fraktion der MSZ. Interessanterweise korrelierten die morphologischen Veränderungen mit einer erhöhten Expression von ß-Tubulin III und einer schwachen Neurofilament Immunoreaktivität, ein Hinweis auf eine neuronale Differenzierung dieser Zellen.
Schlussfolgerungen: Undifferenzierte Zellen aus dem Knochenmark der adulten Ratte konnten mit Hilfe zweier Differenzierungsprotokolle in Zelltypen mit einer neuronalen Morphologie differenziert werden. In weiteren Experimenten soll das Verhalten dieser Zellen in vivo nach Transplantation in pathologisch veränderte Netzhäute von Mausmutanten analysiert werden.

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