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Abstract
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Ein quantitativer Vergleich der Genexpression in zentralen und peripheren humanen RPE-Zellen mittels Real Time RT-PCR
Kociok N., Kirchhof B., Joussen A. M.
Medizinische Einrichtungen der Universität zu Köln, Augenheilkunde, Abteilung für Netzhaut- und Glaskörperchirurgie, Angiogeneselabor, Köln
Hintergrund: Der Phänotyp der altersbedingten Makuladegeneration ist durch eine retinale Degeneration in der Makula gekennzeichnet, während die periphere Netzhaut im wesentlichen intakt bleibt. Es wird angenommen, dass RPE Zellen bei diesem Prozess eine zentrale Rolle spielen. Dabei ist das unterschiedliche Verhalten von zentralen und peripheren RPE-Zellen zumindest teilweise wohl auf eine unterschiedliche Genexpression zurückzuführen. Wir haben daher eine Methode zur Quantifizierung von genspezifischer mRNA aus nur wenigen RPE-Zellen entwickelt, die aus unterschiedlichen Teilen des menschlichen Auges isoliert worden sind.
Methode: Gefrierschnitte von zentralen und peripheren Teilen humaner Spenderaugen wurden auf eine 1,35 mm dicke Polyethylenmembran appliziert. Schnitte mit 5 bis 10 RPE-Zellen wurden mittels Laserdissektionsmikroskopie oder manuell unter einem Binokular in Reaktionsgefäße gebracht. Nach Zelllyse und DNA-Verdau wurde eine reverse Transkription der RNA ohne vorherigen zusätzlichen RNA-Isolationschritt durchgeführt und dabei zwei verschiedene reverse Transkriptasen verwendet. Für das Priming wurden Oligo-d(T) Primer, Zufallsprimer und genspezifische Primer verwendet. Die GAPDH-kalibrierte Genexpression der analysierten Gene wurden